摘要： 本文详细阐述了新型发酵型乳酸菌筛选与鉴定的全过程。从样品采集的源头开始，历经初筛、复筛等一系列严格步骤，运用多种先进的鉴定技术，包括形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法，精准地筛选并鉴定出具有优良发酵特性和潜在应用价值的新型发酵型乳酸菌。这一研究对于丰富乳酸菌资源库、推动发酵产业的创新发展具有重要意义，为开发新型功能性发酵产品提供了坚实的理论和实践基础。

一、引言

随着人们对健康食品需求的日益增长以及发酵工业的快速发展，发酵型乳酸菌作为一类重要的微生物资源，受到了广泛关注。传统的发酵型乳酸菌已在食品、医药、农业等多个领域得到了广泛应用，但为了满足不断变化的市场需求和行业发展的更高要求，筛选具有独特性能的新型发酵型乳酸菌成为了当前研究的热点之一。新型发酵型乳酸菌可能具备更强的发酵能力、更好的益生特性、更高的耐受性等优势，有望在新型发酵产品的开发中发挥关键作用，为相关产业带来新的发展机遇。

二、样品采集

（一）采集来源

自然发酵食品：传统的自然发酵食品是乳酸菌的丰富宝库，如泡菜、酸菜、酸奶、发酵豆制品等。这些食品在长期的自然发酵过程中，蕴含了多种多样的乳酸菌菌株。例如，从不同地区、不同工艺制作的泡菜中采集样品，可能获得适应不同环境条件和具有独特发酵特性的乳酸菌。

动物肠道：动物肠道是乳酸菌的重要栖息场所，尤其是健康动物的肠道内存在着大量的乳酸菌群落。通过采集动物粪便或肠道内容物，可以分离得到与动物肠道共生且具有潜在益生功能的乳酸菌。例如，从健康奶牛的肠道中采集样品，有望筛选出能够耐受胃肠道环境并对人体有益的乳酸菌菌株，为开发乳制品发酵剂提供新的菌种资源。

植物表面：许多植物表面也存在着乳酸菌，这些乳酸菌可能与植物形成共生关系，对植物的生长和健康具有一定的保护作用。例如，从新鲜的蔬菜、水果表面采集样品，有可能发现具有特殊代谢功能或抗菌活性的乳酸菌，为开发天然保鲜剂或生物防治剂提供新的思路。

（二）采集方法与注意事项

无菌操作：在样品采集过程中，严格遵循无菌操作原则是确保获得纯净乳酸菌菌株的关键。使用无菌采样工具，如无菌棉签、无菌镊子、无菌离心管等，避免样品受到外界杂菌的污染。例如，在采集泡菜样品时，先用酒精棉球对泡菜坛口进行消毒，然后迅速用无菌镊子夹取泡菜样品放入无菌离心管中，并立即密封保存，防止杂菌进入。

样品保存与运输：采集后的样品应尽快进行处理或妥善保存，以保证乳酸菌的活性。一般将样品保存在低温、无氧的环境中，如冰盒或厌氧袋中，并尽快送往实验室进行后续分析。在运输过程中，要避免样品受到剧烈震动、高温、阳光直射等不良因素的影响，确保乳酸菌的生存状态不受破坏。

三、初筛

（一）富集培养

选择培养基：根据乳酸菌的营养需求和生长特性，设计专门的选择培养基，以促进乳酸菌的生长并抑制其他杂菌的繁殖。通常选择培养基中含有适量的碳源（如葡萄糖、乳糖等）、氮源（如蛋白胨、酵母提取物等）、维生素、矿物质等营养成分，同时添加一定浓度的抗生素（如万古霉素、氯霉素等）或其他抑菌物质，抑制革兰氏阴性菌和大多数芽孢杆菌的生长，使乳酸菌成为优势菌群。例如，MRS 培养基（Man, Rogosa and Sharpe Medium）是一种常用的乳酸菌选择培养基，其成分能够满足乳酸菌的生长需求，并对常见的杂菌具有一定的抑制作用。

培养条件：控制合适的培养条件对于乳酸菌的富集培养至关重要。一般将样品接种到选择培养基中后，在厌氧或微需氧的环境下进行培养，培养温度通常为 30 - 40°C，培养时间为 24 - 48 小时。不同的乳酸菌菌株对培养条件的要求可能略有差异，因此可以根据实际情况进行适当的调整。例如，对于一些嗜热乳酸菌，可以将培养温度提高到 45 - 50°C，以促进其生长和繁殖。

（二）筛选指标

产酸能力：乳酸菌在发酵过程中能够产生乳酸等有机酸，导致培养基的 pH 值下降。通过检测培养基的 pH 值变化，可以初步判断菌株的产酸能力。一般选择能够使培养基 pH 值显著降低（如 pH < 4.5）的菌株进行进一步筛选，因为较强的产酸能力往往与较好的发酵性能相关。例如，可以使用 pH 计或 pH 试纸定期检测富集培养后的培养基 pH 值，记录并比较不同菌株的产酸情况。

菌落形态特征：观察菌落的形态、大小、颜色、光泽、边缘等特征，可以对乳酸菌菌株进行初步的分类和筛选。乳酸菌的菌落通常呈现圆形、光滑、湿润、白色或乳白色，边缘整齐或略带锯齿状。与其他杂菌的菌落相比，具有一定的特征性差异。例如，在 MRS 平板上，乳酸菌菌落一般较小，直径约 1 - 3 毫米，表面光滑，颜色较浅，而一些污染的霉菌菌落则较大，形状不规则，颜色多样，表面有绒毛状或絮状结构，通过这种明显的菌落形态差异，可以初步排除部分杂菌，提高筛选效率。

四、复筛

（一）发酵性能测试

生长曲线测定：将初筛得到的菌株接种到液体发酵培养基中，在合适的培养条件下，定期测定菌液的 OD 值（Optical Density，光密度），绘制生长曲线。通过生长曲线可以了解菌株的生长速度、对数生长期、稳定期和衰亡期等生长特性，筛选出生长迅速、生长周期短且稳定期生物量高的菌株。例如，在 600nm 波长下测定菌液的 OD 值，每隔 2 - 4 小时测定一次，连续测定 24 - 48 小时，根据 OD 值的变化绘制生长曲线，比较不同菌株的生长情况，选择生长性能优良的菌株进行后续实验。

糖代谢能力分析：测定菌株对不同糖类的利用能力和发酵产物，了解其糖代谢途径和发酵特性。选择能够高效利用多种糖类（如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖等）并产生丰富发酵产物（如乳酸、乙酸、乙醇、二氧化碳等）的菌株，这些菌株在实际发酵应用中具有更广泛的适应性和更高的发酵效率。例如，采用高效液相色谱（HPLC）法或气相色谱（GC）法分析菌株发酵液中的糖类和有机酸含量，确定其糖代谢产物的种类和比例，筛选出具有独特糖代谢能力的乳酸菌菌株。

（二）益生特性评估

耐酸耐胆盐能力：模拟人体胃肠道的酸性环境和胆汁盐环境，测定菌株的耐受性。将菌株分别接种到不同 pH 值的缓冲液（如 pH 2.0 - 3.0 的模拟胃液）和含有一定浓度胆汁盐（如 0.3% - 0.5%）的培养基中，培养一定时间后，测定存活菌数，计算存活率。选择存活率高的菌株，这些菌株能够在胃肠道中存活并发挥益生作用。例如，将菌株在模拟胃液中处理 2 - 3 小时后，取适量菌液接种到 MRS 平板上，进行活菌计数，与未经处理的初始菌数进行比较，计算存活率，筛选出耐酸能力强的菌株；同样，在含胆汁盐的培养基中培养 4 - 6 小时后，进行活菌计数，评估菌株的耐胆盐能力。

抗菌活性检测：通过检测菌株对常见病原菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等）的抑制作用，评估其抗菌活性。采用牛津杯法或打孔法，将乳酸菌菌株的发酵上清液或菌体提取物加入到含有病原菌的平板培养基中，观察抑菌圈的大小，判断菌株的抗菌能力。选择具有较强抗菌活性的菌株，这些菌株有望用于开发天然的抗菌剂或生物防腐剂，保障食品安全和人体健康。例如，在含有大肠杆菌的平板上放置牛津杯，向牛津杯中加入乳酸菌发酵上清液，培养过夜后，观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈的直径，比较不同菌株的抗菌活性强弱。

五、鉴定

（一）形态学鉴定

细胞形态观察：使用光学显微镜或电子显微镜观察菌株的细胞形态，包括细胞形状（如球形、杆状、椭圆形等）、大小、排列方式（如单个、成对、成链状等）以及是否具有芽孢等特征。乳酸菌的细胞形态多样，常见的有短杆状、长杆状、球形等，一般无芽孢，通过细胞形态观察可以对乳酸菌进行初步的分类和鉴定。例如，在光学显微镜下，嗜酸乳杆菌通常呈短杆状，细胞大小较为均匀，排列成链状；双歧杆菌则呈分叉状或 Y 形、V 形等多种形态，细胞排列不规则，通过这些特征性的细胞形态可以将它们与其他细菌区分开来。

革兰氏染色：进行革兰氏染色，确定菌株的革兰氏阳性或阴性属性。乳酸菌属于革兰氏阳性菌，染色后呈现紫色。革兰氏染色结果可以作为鉴定乳酸菌的重要依据之一，同时也有助于排除革兰氏阴性杂菌的干扰。例如，将菌株涂片固定后，依次用结晶紫、碘液、酒精、番红等试剂进行染色处理，在显微镜下观察菌体颜色，若菌体呈紫色，则为革兰氏阳性菌，初步判断为乳酸菌的可能性较大；若呈红色，则为革兰氏阴性菌，需要进一步排查是否为污染菌。

（二）生理生化特性鉴定

糖类发酵试验：检测菌株对各种糖类的发酵能力和发酵产物，这是乳酸菌生理生化鉴定的重要内容之一。将菌株接种到含有不同糖类（如葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等）的发酵管中，培养后观察发酵管中是否产生气体和酸，通过指示剂颜色的变化判断发酵结果。不同的乳酸菌菌株对糖类的发酵能力和产物有所差异，根据糖类发酵试验结果，可以进一步确定菌株的种类。例如，保加利亚乳杆菌能够发酵葡萄糖、乳糖产生乳酸，不产生气体；而某些肠球菌可能发酵葡萄糖产生乳酸和少量气体，通过这些糖类发酵特征可以区分不同的乳酸菌菌株。

过氧化氢酶试验：测定菌株是否产生过氧化氢酶，乳酸菌通常为过氧化氢酶阴性。将菌株接种到含有过氧化氢的培养基上，观察是否有气泡产生，若有气泡产生，则说明菌株产生过氧化氢酶，不属于乳酸菌；若无气泡产生，则为过氧化氢酶阴性，符合乳酸菌的特性。例如，在含有 3% 过氧化氢的平板上滴加少量菌液，若在 1 - 2 分钟内观察到有气泡冒出，则该菌株不是乳酸菌，需要进一步鉴定其所属菌种；若没有气泡产生，则继续进行其他生理生化试验进行鉴定。

其他生理生化指标检测：还可以检测菌株的硝酸盐还原能力、明胶液化能力、吲哚产生能力等生理生化指标，这些指标可以为乳酸菌的鉴定提供更详细的信息，有助于进一步区分不同的乳酸菌属和种。例如，双歧杆菌一般不具有硝酸盐还原能力和明胶液化能力，而某些乳杆菌可能具有较弱的硝酸盐还原能力，通过这些综合的生理生化特性检测，可以更准确地鉴定乳酸菌的种类。

（三）分子生物学鉴定

16S rRNA 基因序列分析：提取菌株的基因组 DNA，扩增 16S rRNA 基因片段，并进行测序。将测序结果与 GenBank 等数据库中的已知序列进行比对，确定菌株的亲缘关系和分类地位。16S rRNA 基因序列具有高度的保守性和特异性，是目前细菌分类鉴定中最常用的分子标记之一。通过比对分析，可以找到与待测菌株序列相似性最高的已知乳酸菌序列，从而确定菌株所属的属和种。例如，使用通用引物对菌株的 16S rRNA 基因进行 PCR 扩增，将扩增产物进行测序后，在 NCBI 网站上进行 BLAST 比对，根据比对结果确定菌株的可能种类，如与嗜酸乳杆菌的 16S rRNA 基因序列相似性达到 99% 以上，则初步鉴定该菌株为嗜酸乳杆菌。

其他分子标记技术：除了 16S rRNA 基因序列分析外，还可以采用其他分子标记技术，如随机扩增多态性 DNA（RAPD）、限制性片段长度多态性（RFLP）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）等，对乳酸菌菌株进行进一步的鉴定和分型。这些技术可以从不同的角度揭示菌株的遗传多样性和特异性，为乳酸菌的鉴定提供更丰富的信息，尤其适用于区分亲缘关系较近的乳酸菌菌株。例如，RAPD 技术通过使用随机引物对菌株基因组 DNA 进行扩增，产生具有种或株特异性的 DNA 指纹图谱，根据图谱的差异可以区分不同的乳酸菌菌株；RFLP 技术则是利用限制性内切酶对菌株的特定基因片段进行酶切，通过分析酶切片段的大小和数量来鉴定菌株，这些分子标记技术在乳酸菌的分类鉴定和遗传多样性研究中具有重要的应用价值。

六、结论

新型发酵型乳酸菌的筛选与鉴定是一项系统而复杂的工作，需要综合运用微生物学、生物化学、分子生物学等多学科知识和技术手段。通过从不同来源采集样品，经过初筛、复筛等严格的筛选步骤，结合形态学、生理生化特性和分子生物学等多种鉴定方法，能够成功筛选并鉴定出具有优良发酵性能和益生特性的新型发酵型乳酸菌菌株。这些新型菌株的发现为发酵产业的发展注入了新的活力，有望开发出更多具有创新性和高附加值的发酵产品，满足人们对健康、美味食品的需求，同时也为乳酸菌在医药、农业、环保等领域的应用拓展提供了有力的菌种支持，具有广阔的应用前景和重要的经济价值。在未来的研究中，随着技术的不断进步和创新，相信将会有更多性能优异的新型发酵型乳酸菌被发现和应用，推动相关产业的持续发展和进步。